Dataset DOI: 10.5061/dryad.8931zcs53

Description of the data and file structure

Comprehensive Transcriptomics Analysis Documentation in each zip files.

1. Assemble: Novel Gene and sRNA Annotation

File Descriptions

*_novel.gtf

Novel gene and sRNA annotation file in GTF format: 

• V1 seqname: Chromosome number

• V2 source: Type (novel gene and sRNA), assembled by Rockhopper software

• V3 feature: Structural type of annotation information, e.g., exon

• V4 start: Start coordinate of annotation region on chromosome

• V5 end: End coordinate of annotation region on chromosome

• V6 score: Annotation score indicating likelihood (dot means empty)

• V7 strand: Strand information (+/-) on chromosome

• V8 frame: Only valid for CDS annotations, values 0/1/2

• V9 attributes: List containing multiple attributes, mainly gene ID, transcript ID, etc.

*_novel.fa

Novel gene and sRNA sequences in FASTA format:

*_novel_gene.xls

Novel gene Pfam functional annotation file in Excel format:

• gene_id: Novel gene identifier

• gene_name: Gene name (uses '-' for novel genes without names)

• gene_chr: Chromosome number where gene is located

• gene_start: Start coordinate on chromosome

• gene_end: End coordinate on chromosome

• gene_strand: Strand information (+/-)

• gene_length: Gene length

• gene_biotype: Gene type

• gene_description: Functional description

*_novel_go.xls

Novel gene GO annotation file in Excel format:

• gene_id: Novel gene identifier

• go_id: GO ID corresponding to gene

• go_ontology: GO database subclass

• go_term: GO term name

*_novel_kegg.xls

Novel gene KEGG annotation file in Excel format:

• gene_id: Novel gene identifier

• pathway_gene_id: Gene ID in KEGG pathway

• pathway_id: KEGG pathway ID

• pathway_name: KEGG pathway name

2. Enrichment: Functional Enrichment Analysis

Analysis Methods

We use clusterProfiler software for GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis based on hypergeometric distribution principle. 

Key Metrics

• GeneRatio: Ratio of differential genes enriched in a pathway to total differential genes

• BgRatio: Ratio of background genes enriched in a pathway to total background genes

GO Enrichment Analysis

File:

• Category: GO database classification (BP, CC, MF)

• GOID: GO identifier

• Description: Functional description of GO term

• pvalue: Significance test p-value

• padj: Adjusted p-value after multiple hypothesis testing

• geneID: IDs of differential genes annotated to GO term

• geneName: Names of differential genes

• Count: Number of differential genes annotated to GO term

KEGG Pathway Enrichment

File:

• KEGGID: KEGG pathway identifier

• Description: Functional description of KEGG pathway

• pvalue: Significance test p-value

• padj: Adjusted p-value after multiple hypothesis testing

• geneID: IDs of differential genes annotated to KEGG pathway

• geneName: Names of differential genes

• keggID: KEGG IDs of differential genes

• Count: Number of differential genes annotated to KEGG pathway

Protein-Protein Interaction (PPI) Analysis

Uses STRING database to analyze protein interaction networks of differential genes.

3. GSEA: Gene Set Enrichment Analysis

Analysis Workflow

1. Calculate differential degree (signal2noise) for all genes

2. Sort genes by differential degree

3. Calculate Enrichment Score (ES) for gene sets

4. Determine significance level using permutation test

5. Normalize ES and calculate FDR to control false positives

Key Files

: GSEA results in TSV format
NAME: Gene set ID in GO/KEGG/Reactome databases

◦ SIZE: Number of genes in gene set

◦ ES: Enrichment Score

◦ NES: Normalized Enrichment Score

◦ NOM p-val: Nominal p-value

◦ FDR q-val: False discovery rate q-value

◦ FWER p-val: Family-wise error rate p-value

4. Mapping: Alignment Results

Reference Genome Alignment

Uses Bowtie2 for genome localization analysis. Results should show >70% mapped reads with <10% multiple mappings.

Mapping Statistics

File:

• Total reads: Number of clean reads after filtering

• Total mapped: Number of reads mapped to genome

• Multiple mapped: Number of reads with multiple mapping positions

• Uniquely mapped: Number of reads with unique mapping position

• Reads map to '+'/'-': Reads mapped to positive/negative strands

Visualization

• Distribution of reads in different genomic regions (Exon/Intergenic)

• Density distribution of reads on chromosomes

5. QC: Quality Control

Quality Metrics

File: 

• Raw reads: Number of raw sequencing reads

• Clean reads: Number of reads after filtering

• Clean bases: Total base pairs in clean data (Gigabases)

• Error rate: Average base sequencing error rate

• Q20/Q30: Percentage of bases with Phred score >20/30

• GC content: Percentage of G/C bases

Data Filtering Steps

1. Remove reads with adapters

2. Remove reads with >10% N bases

3. Remove low-quality reads (≥50% bases with sQ ≤5)

6. Quantification: Gene Expression Analysis

Quantification Method

Uses featureCounts tool from subread software. Gene expression levels are calculated using FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads).

Expression Matrices

: Raw read count matrix

: FPKM expression matrix

: Group-averaged FPKM matrix

Visualization

: Sample correlation coefficient plot

: 2D PCA clustering plot

: 3D PCA clustering plot

: Gene expression level distribution

Violin plot of gene expression levels

Box plot of gene expression levels

7. SNP: Single Nucleotide Polymorphism Analysis

SNP Calling

Uses GATK for SNP and Indel calling after processing alignment results with picard-tools.

SNP Files

: Genotype information of SNP sites

◦ CHROM: Reference sequence name

◦ POS: Position of variant site

◦ ID: Variant identifier (from dbSNP if available)

◦ REF: Reference base

◦ ALT: Alternate base

◦ QUAL: Quality score of variant

◦ GT: Genotype of samples

◦ AD: Allelic depths for REF and ALT

◦ DP: Total sequencing depth at variant site

Annotation

: Functional annotation of SNP sites

◦ GeneID: Gene containing variant

◦ GeneName: Name of gene

◦ FeatureID: Transcript ID

◦ Biotype: Transcript type

◦ HGVS_C: HGVS annotation at DNA level

◦ HGVS_P: HGVS annotation at protein level

◦ EFFECT: Effect of variant

◦ IMPACT: Impact level of variant

8. Structure: Gene Structure Analysis

UTR Analysis

: 3'UTR sequences

: 5'UTR sequences

: Shine-Dalgarno sequence prediction results

: Rho-independent terminator prediction results 

Operon Prediction

File:

• Start: Start coordinate of first gene in operon

• Stop: End coordinate of last gene in operon

• Strand: Strand information (+/-)

• Number of Genes: Number of genes in operon

• Genes: Names of genes in operon

Antisense Transcript Prediction

File: 

• plus_transcript_id: Sense transcript ID

• minus_transcript_id: Antisense transcript ID

• types: Antisense transcript type (enclosed, convergent, divergent)

• overlap_start: Start position of overlapping region

• overlap_end: End position of overlapping region

• overlap_length: Length of overlapping region

sRNA Analysis

: sRNA sequences

: sRNA target gene prediction results

: sRNA expression levels (FPKM)

: BSRD database annotation of sRNAs

: Rfam database annotation of sRNAs

9. SupFile: Supplementary Files

Gene Annotation

: Gene sequences in FASTA format

: Gene annotation information

: Differential expression analysis results for all comparison groups

Functional Annotation

: GO annotation of genes

: KEGG pathway annotation

: KO (KEGG Orthology) annotation

GO Classification

• : GO classification statistics plot

• : Detailed GO classification results